CD4+ T-Zellen sind wichtige Zellen des Immunsystems und spielen für die Abwehr von Erregern eine zentrale Rolle. Da sie in ruhendem Zustand verschiedenste Abwehrmechanismen gegen HIV besitzen, werden sie nur sehr selten infiziert – aber diese wenigen infizierten Zellen bilden im Körper ein stilles Reservoir für HIV, das derzeit von antiviralen Medikamenten nicht erreicht werden kann. Daher kann sich das Virus von dort aus nach Aktivierung der CD4+ T-Zellen wieder verbreiten.
Zu verstehen, wie HIV mit ruhenden CD4+ T-Zellen interagiert, ist essenziell, um neue therapeutische Ansätze zu finden. Für genetische Manipulationen waren ruhende CD4+ T-Zellen kaum erreichbar, weil die verfügbaren Methoden in der Regel sich teilende Zellen voraussetzen, wie Prof. Oliver T. Keppler vom Max von Pettenkofer-Institut der LMU erklärt. „Und ruhende Zellen teilen sich per Definition nicht.“ Als ersten Schritt bei der Entwicklung der neuen Methode optimierte das Wissenschaftler*innen-Team zunächst die Kultivierungsbedingungen.
Dadurch konnten die Forscher*innen diese Zellen nach der Entnahme aus dem Blut gesunder Spender nicht nur wie bisher drei bis vier Tage im Labor am Leben halten, sondern bis zu sechs Wochen. Den entscheidenden Fortschritt brachte dann die Weiterentwicklung der sogenannten Nukleofektion, einer speziellen Methode, mit der Reagenzien in den Kern einer Zelle gebracht werden können. Mit dieser Methode schleusten die Forscher*innen die Genschere CRISPR-Cas in ruhende CD4+ T-Zellen ein, mit der das Genom dieser Wirtszellen gezielt verändert werden kann, etwa indem mittels sogenannter „Knock-Outs“ Gene ausgeschaltet werden.
Knock-In und Knock-Out von Genen
„Diese Kombination hat hoch effizient funktioniert, sodass wir rund 98 Prozent der Zellen erreichen und genetisch manipulieren konnten – und zwar ohne die CD4+ T-Zellen dabei zu aktivieren“, sagt Keppler.
„Besonders spannend war für uns, dass wir mit einer einzigen Nukleofektion bis zu sechs Gene gleichzeitig mit hoher Effizienz ausschalten konnten. Das hat bisher noch niemand in Primärzellen geschafft – und das bei Zellen, die aus einem intakten Organ isoliert wurden.“ Auf diese Weise können die Forscher*innen zukünftig einzelne Gene und ganze Signalwege ausschalten und deren Funktion analysieren. Bereits jetzt konnten sie durch Knock-Out der entsprechenden Gene für vier bisher kontrovers untersuchte zelluläre Faktoren klären, ob diese für die Infektion mit HIV eine Rolle spielen oder nicht.
Zusätzlich verfolgten sie noch einen zweiten Ansatz, den sogenannten „Knock-In“. Dabei werden zusätzliche oder leicht veränderte Gene eingefügt, etwa für das grün fluoreszierende Protein (GFP). Mithilfe dieses Proteins kann analysiert werden, wie sich die Aktivität eines Zielgens unter bestimmten Bedingungen ändert, oder es können bestimmte Proteine markiert werden. „All das zusammen gibt uns jetzt erstmals die Möglichkeit, die Interaktion von HIV mit menschlichen, ruhenden CD4+ T-Zellen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen“, erklärt Adrian Ruhle, der gemeinsamer Erstautor der Studie ist.
„Wir können diese Zellen jetzt aber auch über HIV hinaus in ihrer generellen Funktion als Immunzellen besser untersuchen.“ Langfristig hoffen die Forscher, aus einem besseren Verständnis der Biologie dieser Zellen heraus auch neue Ansätze für die vollständige Eliminierung der HI-Viren aus dem Körper der Patienten zu finden, da derzeit weltweit noch ca. 37 Millionen Menschen mit HIV infiziert sind.
Quelle: Ludwig-Maximilians-Universität München (LMU)
Publikation: Oliver T. Keppler et al.; Rapid, efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses; Nature Methods, 2021; DOI: 10.1038/s41592-021-01328-8
