Um die diagnostischen Tests für PatientInnen nach einer Nierentransplantation zu verbessern, hat ein internationales Forschungsteam eine einfache Urinprobe mit der hochsensiblen CRISPR-Technologie kombiniert. Der neue Test weist zwei häufige, opportunistische Viren nach, die oft PatientInnen nach einer Nierentransplantation infizieren: Zytomegalievirus (CMV) und BK Polyomavirus (BKV). Das Verfahren detektiert auch CXCL9-mRNA, deren Expression während der akuten zellulären Abstoßung von Nierentransplantaten ansteigt.
„Die meisten Menschen denken an Gen-Editierung, wenn sie an CRISPR denken, aber dieses Tool ist auch für andere Anwendungen, speziell für günstigere und schnellere Diagnostik, geeignet“, sagt Dr. Michael Kaminski, Leiter der neuen Arbeitsgruppe „Kidney Cell Engineering and CRISPR Diagnostics“, die am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz Gemeinschaft (MDC) und Charité – Universitätsmedizin Berlin angesiedelt ist.
Kaminski, der als Arzt in der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Nephrologie und Internistische Intensivmedizin der Charité tätig ist, leitete die Testentwicklung während seiner Zeit am „Massachusetts Institute of Technology“ (MIT) in der Arbeitsgruppe von Professor James Collins. 2020 gründete er ein Labor am Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB) am MDC.
Diagnostisches Potenzial von CRISPR
PatientInnen nach einer Nierentransplantation nehmen Medikamente zur Unterdrückung ihres Immunsystems, um das Risiko einer Organabstoßung zu reduzieren. Dies wiederum erhöht das Risiko, an Infektionen zu erkranken. Es ist daher wichtig die PatientInnen sowohl auf mögliche Infektionen, als auch auf Abstoßung des transplantierten Organs hin zu überprüfen.
Üblicherweise werden Bluttests und invasive Nierenbiopsien durchgeführt, die zeitintensiv und teuer sind. Es gibt zwar erschwingliche diagnostische Urintests für eine Vielzahl von Biomarkern, die unter anderem bei Diabetes oder Schwangerschaft eingesetzt werden, diese sind jedoch für den Nachweis von Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, meist nicht geeignet. Hier kommt CRISPR ins Spiel.
Die CRISPR-Technologie kann sehr kleine Segmente einer DNA- oder RNA-Sequenz mit Hilfe eines komplementären RNA-Stücks aufspüren. Bestimmte Arten von Cas-Proteinen schneiden nicht nur die Zielsequenz, sondern auch ein Reportermolekül. Die bei diesem Schneiden entstehende Fluorenzenz zeigt an, ob die Zielsequenz vorhanden ist. Viele Labore haben das diagnostische Potential von CRISPR an synthetischem Material untersucht, aber nur wenige haben echte klinische Proben getestet.
Zweistufiges Assay
„Die Herausforderung besteht darin, klinisch relevante Konzentrationen zu erfassen“, sagt Kaminski. „Es ist ein großer Unterschied, ob man hohe Konzentrationen synthetischer Zielmoleküle im Reagenzglas oder ein einzelnes Molekül in einer Patientenprobe detektiert.“
Das Test, formal Assay genannt, läuft zweistufig ab: Zuerst wird die virale Ziel-DNA in einer Urinprobe vermehrt. Sie wird so oft kopiert bis CRISPR sie erkennen kann, auch wenn nur ein einzelnes Zielmolekül vorliegt. Das Team verwendet ein spezifisches, als SHERLOCK bekanntes CRISPR-Cas13 Protokoll, um das Verfahren für virale DNA zu optimieren. Die Ergebnisse ähneln denen eines Schwangerschaftstests für zuhause.
Ein Teststreifen wird in die vorbereitete Probe getaucht; wenn nur eine Bande auf dem Streifen erscheint, ist die Probe negativ, zwei Banden zeigen an, dass das Virus vorhanden ist. „Es ist spannend zu beobachten, wie die Ergebnisse auf den Teststreifen erscheinen", sagt Robert Greensmith, ein Doktorand im ersten Jahr in Kaminiskis Labor und Mitautor der Veröffentlichung. „Ich arbeite erst seit Neustem mit CRISPR und bin beeindruckt von dieser so robusten Testplattform".
Für den Abstoßungsmarker CXCL9 verwendeten die Forscher ein ähnliches Verfahren. Dazu wird mRNA isoliert und vermehrt und dann durch CRISPR-Cas13 nachgewiesen. Bei sehr geringen Viruskonzentrationen erscheint die zweite Bande auf dem Teststreifen schwach, was eine klare Interpretation erschwert.
Mehr als 100 Proben analysiert
Daher entwickelte das Team eine Smartphone-App, die Bilder des Teststreifens analysiert und basierend auf der Bandenintensität eine endgültige Entscheidung trifft. Nach viel Aufwand zur Optimierung des Verfahrens verwendeten die Forscher ihren Assay zur Analyse von mehr als 100 Proben von PatientInnen nach Nierentransplantationen.
Der Assay erwies sich als präzise und konnte selbst bei geringer Viruslast BKV- oder CMV-Viren detektieren und eine akute zelluläre Transplantatabstoßung korrekt anzeigen. Um das diagnostische Potenzial des Testes besser einzuschätzen, interessiert sich Kaminski als Arzt und klinischer Forscher für Studien, die den Test mit herkömmlichen Verfahren vergleichen. Außerdem würde er gerne nach Wegen suchen, den Assay noch einfacher zu machen.
Im Augenblick müssen die Proben zur Vorbereitung erhitzt werden und der Test umfasst mehrere Schritte. Während er im Krankenhausumfeld eingesetzt werden kann, ist er für eine Testung zuhause noch nicht geeignet. Das ultimative Ziel ist ein einstufiges Verfahren, das mehrere Parameter quantitativ messen kann.
So könnten PatientInnen Änderungen im Vergleich zu ihren individuellen Normalwerten feststellen. Kaminski weist darauf hin, dass dieser Test auch für andere immungeschwächte PatientInnen mit einem Risiko für virale Infektionen nützlich sein, und CRISPR-basierte Diagnostik möglicherweise auch für andere Organtransplantate genutzt werden könnte.
Quelle: Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC)
Publikation: Michael M. Kaminski, et al.; A CRISPR-based assay for the detection of opportunistic infections post-transplantation and for the monitoring of transplant rejection; Nature Biomedical Engineering, 2020; DOI: 10.1038/s41551-020-0546-5
